反相液相色譜法測定人血漿中格列吡嗪濃度

 [摘要] 目的 建立反相液相色譜法測定人血漿中格列吡嗪濃度的方法。
          方法：格列吡嗪血漿樣品在酸性條件下以二氯甲烷-正己烷（50：50）提取，以格列齊特為內標：色譜柱：Nova-pak C18柱（4.6mm×250mm，4μm）；流動相：甲醇-0.03mol/L。磷酸二氫鉀（pH值=3.0）（59：41）；流速：O.8 mL/min；檢測波長：228nm。結果：標準曲線線性范圍20～1000μg/L；回歸方程：Y=0.0034X一0.512，r=0.9992，血漿中格列吡嗪zui低檢測限為15μg/L。平均提取回收率為（86.8±5.7）％，平均回收率為（104.3±4.3）％，日內RSD≤2.9％，日間RSD≤4.9％。結論：該方法具有良好的準確性、精密性和較高的靈敏度，適用于格列吡嗪的藥動學研究和治療監測。

【關鍵詞】格列吡嗪；血藥濃度；反相液相色譜法
         建立人血漿格列吡嗪含量測定方法，對服用格列吡嗪的患者進行藥動學研究，對于指導患者合理用藥、減少不良反應的發生有一定的臨床意義。筆者建立了安全可靠、準確、靈敏的測定人血漿中格列吡嗪的反相液相色譜（RP-HPLC）法，適用于人體內格列吡嗪藥動學研究。 

        1 儀器與試劑
         1．1 儀器Waters液相色譜儀：5l5泵；996二極管陣列檢測器；Rheodyne 7725i進樣器；2010Millenium色譜管理系統（美國Waters公司）；DZF-3型真空干燥箱（上海醫用恒溫設備廠）；XW-80A漩渦混合器（上海醫科大學儀器廠）。
         1．2 試劑 格列吡嗪對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：960804），格列齊特原料（廣東省藥品檢驗所）；空白血漿（廣州市血液中心）；甲醇（色譜純，天津四友生物醫學技術有限公司）；二氯甲烷、正己烷、磷酸二氫鉀均為分析純。

        2 方法與結果 
        2．1 色譜條件分析柱：美國Waters Nova-pak Cl8柱（4.6mmx 250mm，4μm）；流動相：甲醇-0.03mol/L。磷酸二氫鉀（pH值=3.0）（59 ：41）；流速：0.8mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：228nm；進樣量：10μL。
         2．2 內標溶液的配制 精密稱取格列齊特原料適量置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成300mg/L。的內標儲備液。精密量取內標儲備液1.0mL置于50mL容量瓶中，用甲醇配成濃度為6mg/L 的內標溶液。
        2．3 標準溶液的配制 精密稱取格列吡嗪對照品適量置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成100 mg/L。儲備液。分別精密量取格列吡嗪儲備液1.0mL置于50mL容量瓶中，2.0mL置于25mL容量瓶中，用甲醇配成濃度分別為2.8mg/L的格列吡嗪標準溶液。
        2．4 洋品處理 取1.0mL人血漿樣品，精密加入50μL內標溶液和100μL鹽酸溶液（2.0mol/L），混合均勻，加入3.0mL二氯甲烷-正己烷（50：50）置于漩渦混合器上混合5min。離心5min（6000r/min）。取有機相置于另一試管中。水相用同法重復提取2次，合并有機相，置于40℃真空干燥箱中干燥。殘渣用50μL甲醇-純化水（59：41）溶解，l0μL進樣。
        2．5色譜行為在上述色譜條件下，格列吡嗪、內標峰形對稱并與內源性雜質分離良好?格列吡嗪保留時間為l0.7 min，內標保留時間為l3.8min。格列吡嗪甲醇溶液、人空白血漿和血漿樣品色譜圖。
        2．6 標準曲線的制備 于空白血漿中加入不同濃度的格列吡嗪標準溶液適量，使藥物濃度分別為20，50，100，200，500，l000μg/L，按前述方法提取、測定。以格列吡嗪與內標物的峰面積比（以吸收度之比表示）對格列吡嗪血漿濃度（C）進行線性回歸。格列吡嗪標準曲線方程為Y=0.0034C一0.0512，r=0.9992。格列吡嗪血漿樣品在20～1000μg/L范圍內線性關系良好。
        2．7 回收率試驗 于空白血漿中加入適量格列吡嗪標準溶液，得50，200，500μg/L 3種濃度的質控血漿，按前述方法提取、測定。以1d內5次測得的格列吡嗪濃度計算方法回收率，并以其峰面積與相應濃度未經提取的格列吡嗪甲醇溶液直接進樣所得峰面積的比值計算提取回收率。3種質控血漿的平均提取回收率為（86.8±5.7）％，平均方法回收率為（104.3±4.3）％，日內RSD≤2.9％，日間RSD≤4.9％。
        2．8 精密度試驗 按“回收率試驗”項下方法配制格列吡嗪質控血漿，提取后測定。以1d內5次測定的格列吡嗪濃度計算日內精密度。另于5d內取上述格列吡嗪質控血漿每天各測定1次，計算13間精密度。
         2．9 zui低檢測 限于空白血漿中加入適量格列吡嗪工作溶液，制得濃度<20μg/L并逐漸降低的一組樣品。對每個濃度的樣品進行提取、測定，以能達到S／N=3時樣品的zui低濃度為zui低檢測限。格列吡嗪zui低檢測限為l5μg/L。

         3 討論
        目前國內文獻報道大多使用乙醚提取血漿中格列吡嗪 。乙醚雖然容易揮干，但使用前需要重蒸，操作繁瑣且不安全。筆者采用毒性較小的二氯甲烷-正己烷（50：50）作為提取溶劑，操作簡便、安全可靠，更適于推廣應用。在實驗中發現lmL血漿中加入5mL二氯甲烷．正己烷（50：50）提取格列吡嗪容易出現乳化現象。經反復試驗，血漿樣品與提取溶劑體積比為l：3可避免產生乳化現象。為了使之提取*，筆者對血漿樣品進行3次提取，結果顯示本法的提取回收率與固相萃取法（SPE）接近，兩者均>80％。
        本實驗流動相pH值為3.0，較文獻報道為低，使格列吡嗪峰形得到了改善，提高了定量結果的準確性。


[參考文獻]
[1] 江志強，張奇志，蔣新國，等．格列吡嗪2種片劑的藥動學和人體生物利用度比較[J]．中國新藥與臨床雜志，2000，19（5）：381—384．